唐志鹏，男，医学博士，主任医师，教授。上海中医院脾胃病科主任医师，上海中医药大学、上海市中医药研究院脾胃病研究所所长。擅长诊治溃疡性结肠炎、克罗恩病、胃食管反流病、慢性胃炎、消化性溃疡、功能性消化不良、肠易激综合征、慢性肝病、食欲不振、腹泻、便秘等疾患，以及虚证调理。
溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)是一种主要累及直肠、结肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎症。肠道菌群通过代谢产物、改变黏膜屏障和调节免疫等多种方式参与UC的发生和发展，被认为是肠道炎症的触发和启动因素。舌象由舌质和舌苔两部分构成，是中医望诊的重要组成部分。舌苔与脾胃功能密切相关，中医学认为其是脾胃熏蒸谷气、胃津上朝、凝聚于舌面而生，故舌苔变化最能反映脾胃相关疾病的轻重深浅。现代研究认为，舌苔的形成与基因表达谱、蛋白组学、微生物组学以及代谢组学等均有关联，其中微生态研究技术为舌苔的形成机制提供了新的研究视角和平台。
薄白苔和黄腻苔分别是UC虚证(脾气虚弱证)和实证(大肠湿热证)的典型舌苔，本研究选取以上两种舌苔的UC患者的粪便作为标本，采16SrDNA基因测序分析技术和生物信息学方法研究肠道菌群的多样性和丰度，探讨UC患者舌苔与肠道菌群之间的关系。现将有关结果总结报道如下。
01材料与方法
1.1研究对象来源本研究薄白苔、黄腻苔UC患者均来源于年3月至年2月上海中医院脾胃病科、上海中医药大学附医院消化内科、医院消化内科，薄白苔的健康对照者来源于同期上海中医院体检中心。
1.2诊断标准UC的诊断标准参照中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组制定的《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(年，广州)》。
舌象诊断参照《中医诊断学》中的有关标准。在光线充足(自然光)的情况下，被检者取坐位并将舌伸出口外，舌体充分暴露，并且尽量放松，医者在排除吸烟、药物或食物染苔、刮苔等因素后对舌苔进行诊断。
1.3纳入标准
1.3.1UC患者纳入标准①符合上述疾病诊断标准，舌苔表现为薄白苔或黄腻苔；②年龄18～80岁；③肠镜检查时间距离标本采集时间＜6个月；④依从性好，并签署知情同意书。1.3.2健康者纳入标准近3个月内无腹泻、便秘、腹胀等胃肠道症状，粪常规及隐血检查无明显异常。1.4排除标准①近4周内服用过抗生素及微生态制剂者，或有注射用英夫利西单抗(类克)等生物制剂治疗史者；②目前接受的治疗方案中含有激素者；③样本留取量不足或在留取过程中有污染者；④患有感染性疾病或严重创伤、手术、感染者；⑤有肠道切除手术史(不包括阑尾切除)者；⑥合并其他自身免疫性疾病、结肠恶性肿瘤者；⑦有使舌苔失真的不利因素，比如长期吸烟、服用易染苔药物者；⑧近7d内曾行肠道准备者。
1.5标本采集提供无菌粪便采集盒，要求受检者将当日新鲜粪便的中段部分放置其中，采集量约2g，收集标本后尽快放入－80℃超低温冰箱冷冻保存。所有样本收集完毕后统一送至检测机构。
1.6研究方法将样本融化后，充分混匀并离心，取适量样本进行检测，根据E．Z．N．A．?soil试剂盒说明书完成基因组DNA抽提，利用NanoDrop检测DNA的浓度和纯度；选择细菌16SrDNA基因的测序类型，用引物对V3-V4可变区进行PCR扩增实验(引物序列F：5’-GTGCCAGCCMGCCGCGG-3’；R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。回收PCR产物，纯化、洗脱之后根据IlluminaMiSeq平台将扩增片段构建PE2*文库，并在Illumina公司的MiseqPE平台测序。原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，FLASH软件拼接。最后采用UPARSE软件(version7．1)根据97%的相似度对序列进行OTU(OperationalTaxonomicUnits)聚类，比对Silva数据库(SSU)，进而了解样本测序结果中的菌种、菌属等物种生物信息，设置比对阈值为70%。以上16SrDNA基因测序和生物信息学分析在上海美吉生物医药科技有限公司进行。1.7统计学方法1.7.1基线统计方法采用SPSS25．0软件对基线数据进行统计分析。计数资料选用χ2检验，计量资料采用单因素方差分析，等级资料均使用Wilcoxon秩和检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。1.7.2生物信息学分析在分析Alpha多样性指数差异和物种组成差异时，选用Wilcoxon秩和检验，以P＜0．05为差异有统计学意义；在分析菌群在纲、目、科分类学水平上差异时，使用LDA分数估计每个物种的效应尺度，以LDA＞2．0为显著差异。02结果
2.1一般资料本研究共纳入UC薄白苔患者、UC黄腻苔患者、健康对照者各35例，分别设为UC薄白苔组(UC_W)、UC黄腻苔组(UC_Y)、健康对照组(HC)。各组性别、年龄、体质量指数(BMI)差异无统计学意义(P＞0．05)；UC_W、UC_Y在病程、病变范围、疾病活动度等方面比较，差异无统计学意义(P＞0．05)，具有可比性。见表1。
2.2物种注释与评估
2.2.1Rank-Abundance曲线HC组患者肠道菌群的物种丰度和均匀度最好，UC_W组次之，UC_Y组肠道菌群的物种丰度和均匀度最低。见图1。
图1各组肠道菌群Rank-Abundance曲线图2.2.2Alpha多样性分析与HC组比较，UC_W、UC_Y组患者肠道菌群物种的丰富度和多样性显著降低(P＜0．)；与UC_W组比较，UC_Y组患者肠道菌群物种丰富度略低，但差异无统计学意义(P＞0．05)。见图2。
图2各组肠道菌群Alpha多样性分析2.2.3Venn图从图3可以看出，UC_W、UC_Y组患者肠道菌群物种(OTU)数量少于HC组，UC_W组患者肠道菌种数量多于UC_Y组。
图3各组肠道菌群Venn图2.3物种差异分析
2.3.1门水平差异分析与HC组比较，UC_W、UC_Y组患者肠道菌群中厚壁菌门(Firmicutes)明显减少(P＜0．05)。UC_W组与UC_Y组患者肠道菌群差异较小，优势菌门差异均无统计学意义(P＞0．05)，仅蓝细菌门(Cyanobacteria)差异有统计学意义(P＜0．05)。见图4(仅显示差异菌种)。
图4各组肠道菌群在门水平差异比较2.3.2属水平差异分析与HC组比较，UC_W组患者肠道菌群中埃希氏-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)、链球菌属(Streptococcus)等明显增多(P＜0．05)，罕见小球菌属(Subdoligranulum)、多尔氏菌属(Dorea)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、罗氏菌属(Roseburia)等明显减少(P＜0．05)。
与HC组比较，UC_Y组患者肠道菌群中埃希氏-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)、乳杆菌属(Lactobacillus)等明显增多(P＜0．05)，多尔氏菌属(Dorea)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、考拉杆菌(Phascolarctobacterium)、罗氏菌属(Roseburia)等明显减少(P＜0．05)。
与UC_W组比较，UC_Y组患者肠道菌群链球菌属(Streptococcus)增多(P＜0．05)，巨球型菌属(Megasphaera)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、普氏菌属(Prevotella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)等明显减少(P＜0．05)。见图5。
图5各组肠道菌群在属水平差异比较2.3.3肠道菌群LDA判定(纲、目、科水平)以上分析了在门、属两个分类学水平上菌群组成差异，然而从门到属存在多种微生物，故根据UC_W和UC_Y组在纲、目、科水平上肠道菌群特征和差异做了两组的LDA判定，以LDA＞2．0为有显著差异。
UC_W组患者肠道菌群中普氏菌科(f_Prevotellaceae)、奈瑟氏球菌目(o_Neisseriales)、奈瑟氏球菌科(f_Neisseriaceae)丰度显著多于UC_Y组，为UC_W组的特色菌群。
UC_Y组肠道菌群中杆菌纲(c_Bacilli)、乳杆菌目(o_Lactobacillales)、链球菌科(f_Streptococcaceae)、消化链球菌科(f_Peptostreptococcaceae)丰度显著高于UC_W组患者，为UC_Y组的特色菌群。见图6。
图6UC_W与UC_Y肠道菌群在纲、目、科水平上LDA判定图03讨论
肠道菌群紊乱被认为是UC发生、发展的主要促使因素之一。在遗传易感的基础上，肠道菌群的失调会破坏共生细菌与宿主免疫系统之间的动态平衡，诱发肠道产生过度适应性免疫应答，进而诱导UC的发生。肠道微生物可通过影响营养物质吸收(如短链脂肪酸、胆碱、胆汁酸)、诱发免疫紊乱、改变肠道通透性和脑肠轴等多种途径影响宿主的健康。研究发现，UC患者肠道菌群的多样性、丰富度均明显低于健康人群，优势菌菌种的比例亦有明显变化。
运用现代科学技术将传统中医药与微生态环境相联系是当下的研究热点，目前大多集中在UC中医证型与肠道菌群关系的研究，认为UC不同中医证候患者肠道菌群的菌种组成和细菌丰度存在一定的差异。如丁庞华等发现，UC大肠湿热证患者肠道中变形菌门和疣微菌门显著增加，拟杆菌门和厚壁菌门显著降低。亦有学者采用16SrDNA技术得出结论：UC大肠湿热证患者拟杆菌门丰度低于UC脾虚湿蕴证，厚壁菌门丰度高于UC脾虚湿蕴证，且在属水平上存在26种有明显差异的菌属，但二者在肠道菌群的物种多样性方面无显著差异。
近年来，微生态学的发展为舌苔形成机制的研究开拓了新视野，舌苔的形成可能与肠道菌群的组成和数量有关。本研究排除性别、年龄、BMI、病程、病变范围、疾病活动度和肠镜评分等可能影响肠道菌群的因素后，发现UC薄白苔和黄腻苔患者肠道菌群丰富度和多样性无明显差异，但两者在菌种组成和丰度上均存在一定的差异。门水平分析结果显示，UC黄腻苔患者肠道蓝细菌门丰度显著多于UC薄白苔患者(P＜0．05)。蓝细菌门对肠道影响尚不明确，但有学者研究发现，在早衰小鼠模型中，蓝细菌门丰度显著增加，猜测蓝细菌门失调会加速机体衰老。此外，还有研究发现蓝细菌门与低密度脂蛋白(LDL-C)水平呈正相关，其数量增多可影响人体健康。
属水平分析结果显示，UC_Y组患者中链球菌属显著多于UC_W组。有研究发现，较之健康者和UC脾虚湿蕴证患者，UC大肠湿热证患者肠道菌群中链球菌属明显增加，并由此猜测链球菌属的过度生长可能是UC大肠湿热证的病理机制。链球菌属可联合肠道中的其他病原体刺激RLR信号通路，从而产生促炎性细胞因子引发炎症反应，进而损伤肠道屏障。有研究表明，链球菌可以促进Th17细胞增加以触发免疫紊乱，加重由干扰素-γ分泌增加引起的结肠炎症反应。此外，链球菌属在原发性硬化性胆管炎(PSC)患者中显著增多，而PSC与炎症性肠病(IBD)关系密切，是IBD的常见并发症之一。同时，UC黄腻苔患者肠道菌群中奈瑟氏菌属、普氏菌属明显减少(P＜0．05)。Hirano等通过研究健康者及UC患者不同炎症部位的肠黏膜活检标本发现，奈瑟氏球菌属和普氏菌属在UC患者肠道炎症部位的丰度少于健康者和UC患者肠道非炎症部位。王建林亦通过研究发现，UC患者肠道中普氏菌属显著降低。普氏菌属被认为是膳食纤维的有效降解剂，对蛋白质的消化和氨基酸的吸收有重要意义。普氏菌属的P．histicola可通过调节系统性免疫反应抑制炎症，减少促炎因子Th1和Th17细胞的产生，并有促进CD4+及调节性T细胞增殖的作用。
在其他分类学水平方面，UC黄腻苔患者存在明显增多的杆菌纲和消化链球菌科，杆菌纲部分菌种被认为是潜在的致病菌，可以产生磷脂酶、肠毒素、呕吐毒素、溶血素、非溶血性毒素等，危害人体健康。消化链球菌科P．anaerobic则可通过Toll样受体2和4(TLR2和TLR4)增强细胞内活性氧化物(ROS)水平，ROS能够促进胆固醇的生物合成，最终导致细胞增殖增强和肿瘤发生。
Cani认为，在菌群研究中，特定细菌的有益或有害作用可能受多种因素影响，而不是绝对的，建议在菌群研究中应注重关联性而非因果性。本研究运用高通量测序技术，发现了UC患者肠道菌群的物种丰富度和多样性较健康者明显下降，具体表现为有益细菌减少，参与炎症反应的致病菌增多，这些改变可能影响人体的免疫平衡。UC薄白苔患者和黄腻苔患者存在不同的肠道菌群特征，相对于UC薄白苔患者，UC黄腻苔患者肠道中具有保护作用的菌群减少，而产生有害代谢产物的菌群增多，进而我们推测UC黄腻苔患者肠道菌群失调更加严重。肠道菌群检测可以为舌诊现代化提供一定的信息，但本研究为前期探索性研究，肠道菌群是否参与了舌苔的形成及其具体的作用机制有待进一步探明。
文章出处：李丹,姚颖梬,戴彦成,张亚利,唐英觉,朱儒雅,石裕,唐志鹏.溃疡性结肠炎薄白苔和黄腻苔患者的肠道菌群特征分析[J].上海中医药杂志,,54(12):15-20.预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇