LonicerintargetsEZH2toalleviateulcerativecolitisbyautophagy-mediatedNLRP3inflammasomeinactivation
本文于年2月发表在ActaPharmaceuticaSinicaB（IF：7.）。忍冬苷(Lonicerin)：是从金银花中分离得到的黄酮苷类化合物，具有抗炎和免疫调节作用，且证实忍冬素对DSS（葡聚糖硫酸钠）引起的结肠炎的保护作用。EZH2（果蝇Zeste基因增强了人类同源物2）：EZH2促进自噬相关蛋白5的表达，从而增强了自噬，加速了自身溶酶体介导的NLRP3的降解。动态模拟研究表明，EZH2残基(His和Arg)的突变大大降低了忍苷素的保护作用。NLRP3炎症体是一种多分子复合物，由含有caspase募集结构域(Asc)和效应蛋白caspase-1的适配器-凋亡相关斑点样蛋白组成寻找针对NLRP3炎症体激活及随后产生的IL-1β的药物候选物可作为UC潜在治疗的抗炎策略
方法与结果
1证明忍冬苷药效的实验设计
1.1动物给药及分组
雌性C57BL/6小鼠(体重20~22g；年龄6~8周龄)正常组、忍冬苷(3、10、30mg/kg)、DSS组、5-氨基水杨酸饲喂2.5%DSS，7d后恢复3d在DSS治疗开始前48小时灌肠给药，每日给药，连续10天，忍冬素组则采用相同体积灌胃用药。实验结束取鼠的血和组织，检测指标为DAI指数、脾脏系数、MPO、组织病理学观察、用免疫荧光法测定F4/80巨噬细胞在结肠组织中的浸润情况。观察不同剂量忍冬苷对心脏、肝、脾、肺、肾和结肠等器官的明显影响和组织学变化
1.2结果
忍冬苷(10和30mg/kg剂量组小鼠黏膜损伤、炎症细胞浸润及隐窝丢失均有明显改善(图1F)。忍冬苷(10和30mg/kg)可明显阻断F4/80巨噬细胞在结肠固有层中的分布(图1G)，因此忍冬苷10、30mg/kg药效较好。不同剂量(支持信息图)下，未观察到心脏、肝、脾、肺、肾和结肠等器官的明显影响和组织学变化说明不同剂量的忍冬苷口服无副作用。
Figure1LonicerinamelioratesDSS-inducedexperimentalcolitis.TheC57BL/6micewerefedwith2.5%dextransulfatesodium(DSS)for7days,followedbynormaldrinkingwaterfor3days.Lonicerin(3,10,and30mg/kg)and5-ASA(mg/kg)wereorallyadministrateddailyforconsecutive10days.Attheendoftheexperiment,themiceweresacrificed,thespleensandthecolonswerecollected.(A)Thebodyweightchange,(B)thediseaseactivityindex(DAI),(C)thecolonlength,(D)thespleenindex,(E)themyeloperoxidase(MPO)activityincolonsweremeasured.
(F)thehistopathologicaldamageofcolonswasdetectedbyusingHEstainingandthenscoredasdescribedinthe“materialsandmethods”section,andtheimagesweretakenat×magnification(scalebar:50μm).(G)theinfiltrationofF4/80+macrophagesincolonictissueweredeterminedbyusingimmunofluorescenceassay,andtheimagesweretakenat×magnification(scalebar:50μm).Dataareexpressedasmean±SEMofsixmiceineachgroup.##P0.01vs.normalgroup;
*P0.05and**P0.01vs.DSSgroup.
2证明忍冬素特异性抑制NLRP3炎症细胞的活化
2.1实验内容：对收集到的小鼠结肠组织中细胞因子的mRNA和蛋白水平进行了检测。并分离结肠巨噬细胞和结肠上皮细胞，检测忍冬苷对两个细胞Caspase-1，IL-1β和IL-18表达的影响。另外LPS联合ATP或MSU或nigericin激活NLRP3炎症小体制造骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)和人单核细胞株THP-1的炎症模型，将忍冬素（3，10，30μ/L）不同剂量炎症细胞。
2.2结果：忍冬素特异性的抑制巨噬细胞分泌的caspase-1，IL-1β和IL-18的蛋白表达（图2C、D）。不同剂量的忍冬素可明显抑制THP-1细胞和BMDMs细胞NLRP3激活导致Caspase-1和IL-1β的蛋白表达（图2E、F、H），因此证明忍冬素是NLRP3炎症小体的广谱抑制剂。
Figure2LonicerinspecificallyinhibitsNLRP3inflammasomeactivationincolonicmacrophages.(A–D)ThemiceweresubjectedtotheDSS-inducecolitis,andthecolonswerecollectedonDay10.Theproteinexpressionofcleavedcaspase-1incolonswasdeterminedbyusingWesternblottingassay(A);thelevelsofIL-1βandIL-18incolonsweredetectedbyusingELISA(B);theimmunoblotanalysisofcleavedcaspase-1incolonicmacrophagesandepithelialcells(C);theproductionofIL-1βandIL-18incolonicmacrophagesandepithelialcells(D).(E)–(H)TheTHP-1
cells(pretreatedwithnmol/LPMAfor3h)andBMDMsweretreatedwithLPS(ng/mL)for3h,andthenculturedwithlonicerin(3,10,and30μmol/L)for6h,followedbyincubationwithATP(5mmol/L)for1h,nigericin(4μmol/L)for3hormonosodiumuratecrystals(MSU,μg/mL)for6h.Theproteinexpressionsofcleavedcaspase-1andcleavedIL-1βweredeterminedbyusingWesternblottingassay(EandG);theproductionofIL-1βandIL-18wasanalyzedbyELISA(Fand
H).Dataareexpressedasmean±SEMofsixmiceineachgrouporatleastthreeindependentexperiments.##P0.01vs.Normalgroup;*P0.05and**P0.01vs.DSSorLPS+ATPorLPS+nigericinorLPS+MSUgroup.
3忍冬素是如何抑制NLRP3炎症小体激活
3.1实验设计
为了确定金银花素起作用的确切阶段，他们在NLRP3复合物的不同部位进行了共沉淀。收集BMDM和分化的THP-1细胞，用冷PBS冲洗3次。然后在冰上用RIPA裂解缓冲液裂解30min。12,rpm(R，Eppendorf)离心10min，4°C离心10min后，取上清液与1μgASC抗体孵育一夜。第二天，再用蛋白A+G琼脂糖珠在室温下再培养4h。在0rpm(R，Eppendorf)离心10min后，用裂解缓冲液洗涤琼脂糖珠4次。最后，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离免疫沉淀蛋白，用特异性原抗体捕获。采用蛋白质合成PAN抑制剂环己酰亚胺(CHX)评价NLRP3在THP-1和BMDM细胞中的稳定性。应用蛋白酶体抑制剂MG-和溶酶体抑制剂3-甲海拉汀(3-MA)探讨了忍冬苷介导的NLRP3降解途径。
3.2结果
发现细胞对NLRP3炎症小体组装的抑制浓度为3μ/L(图3A)。而且，在LPS引发前加入忍冬苷时，需要10倍浓度才能影响p65和TNF、Il6、NLRP3的磷酸化、核转移以及Il1mRNA的表达(图3B-D)。并溶酶体降解是NLRP3炎症小体决定性的降解途径。这些实验表明，低浓度的忍冬苷可延缓NLRP3炎症小体的组装，且忍冬苷可引起NLRP3的溶酶体降解，从而阻止巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化。
Figure3LonicerinenhancesNLRP3degradationtodisruptassemblyofNLRP3inflammasome.(A)ThedifferentiatedTHP-1cellsandBMDMsweretreatedwithLPS(ng/mL)for3h,andthenculturedwithlonicerin(3,10,and30μmol/L)for6h,followedby1hincubationwithATP(5mmol/L).TheassemblyofNLRP3inflammasomewasdetectedbyusingco-immunoprecipitationassay.(B)–(D)ThedifferentiatedTHP-1cellsandBMDMswereculturedwithlonicerin(3,10,and30μmol/L)for6h,andthentreatedwithLPS(ng/mL)fortheindicatedtimes.The
phosphorylationandnucleartranspositionofNF-κBP65weredetectedbyusingwesternblottingassay(B);themRNAexpressionsofTnf,Il6,Nlrp3aswellasIl1weredetectedbyusingqPCRassay(C)and(D).(E)ThedifferentiatedTHP-1cellsandBMDMsweretreatedwithLPS(ng/mL)for3h,andthenculturedwithlonicerin(3,10,and30μmol/L)for6h.TheproteinexpressionofNLRP3wasdetectedbyusingWesternblottingassay.(F)ThedifferentiatedTHP-1cellsandBMDMswerepre-treatedwithcycloheximide(CHX,15μg/mL)andLPS(ng/mL)for3h,andthenculturedwithlonicerin(30μmol/L)for6h.TheproteinexpressionsofNLRP3weredetectedbyusingWesternblottingassay.(GandH)ThedifferentiatedTHP-1cellswerepre-treatedwithMG-(20μmol/L)or3-methyladenine(3-MA,20μmol/L)andLPS(ng/mL),CHX(15μg/mL)for3h,followedbyincubationwithlonicerin(30μmol/L)for6h.TheproteindegradationandexpressionofNLRP3wasdetectedbyusingWesternblottingassay.(I)TheC57BL/6miceweresubjectedtoDSS-inducedcolitismodel,lonicerin(3,10,and30mg/kg)and5-ASA(mg/kg)wereorallyadministrateddailyforconsecutive10days.Attheendoftheexperiment,themiceweresacrificed,thecolonswerecollectedandtheproteinexpressionofNLRP3incolonswasdetectedbyusingthewesternblottingassay.Dataareexpressedasmean±SEMofatleastthreeindependentexperimentsorsixmiceineachgroup.##P0.01vs.normalgroup;*P0.05vs.LPS+ATPgrouporDSSgroup.
4自噬在忍冬素抑制NLRP3炎症体的作用
4.1实验设计
为了确定忍冬苷介导的自噬相关蛋白5（ATG5）抑制NLRP3炎症激活和减轻结肠炎分组：正常组、DSS组、腺相关病毒(AAV)-扰码RNA组、AAV-ATG5shRNA组、金银素(30mg/kg)+AAV-超链RNA(30mg/kg)+AAV-ATG5shRNA组和雷帕霉素(2mg/kg)组。并将ATG5shRNA给了LPS启动分化的THP-1和BMDM，体外观察ATG对自噬体的影响。透射电镜(TEM)观察自噬体的产生、Westernblotting检测自噬生物标记物LC3B-I/II和p62的表达和结肠组织中ATG5的表达。
4.2结果
忍冬苷浓度依赖性的方式促进自噬或抑制自噬的末端步骤(图4A和B)。忍冬苷处理LPS分化的THP-1细胞和BMDM，结果表明，在BafA1和CQ存在下，THP-1和BMDM中LC3B标记的液泡形成增加，提示忍冬苷可能促进自噬(图4C)。透射电镜(TEM)显示，金银花素能显著促进自噬体的产生(图4D)ATG5在3/10/30μmol/L时，自噬小体THP-1细胞高表达(2.0/3.2/5.4倍)，BMDMs高表达(2.2/3.9/6.3倍)，而另一种自噬引发剂ATG7在相同浓度下无变化(图4e)。因此ATG5启动自噬过程并控制NLRP3炎症小体的激活。在DSS诱导的结肠炎小鼠中，忍冬苷(10，30mg/kg)显著增加了结肠中ATG5的表达((图4F))。ATG5shRNA在LPS启动分化的THP-1和BMDM中，抑制NLRP3炎症复合体的形成。Caspase-1、IL-1β的蛋白表达及IL-1β、IL-18的释放同时被逆转(图5B和C)。证明调控NLRP3炎性小体激活的另一个关键过程是自噬，而不依赖于忍冬苷驱动的NLRP3炎症小体失活。同时体外实验证明AAV-ATG5shRNA消除了忍冬苷对溃疡性结肠炎的病理和组织学的改善作用。
Figure4Lonicerinpromotesautophagyinmacrophages.(A)–(E)ThedifferentiatedTHP-1cellsandBMDMswerepre-treatedwithLPS(ng/mL)for3h,andthenculturedwithlonicerin(3,10,and30μmol/L)for6h.TheproteinexpressionsofLC3B-II/I(A)andP62(B)weredetectedbyusingWesternblottingassay;theLC3Bdotformationwasdetectedbyimmunofluorescenceassay,andtheimagesweretakenat0×magnification(scalebar:10μm)(C);theformationofautophagosomewasdetectedbyusingtransmissionelectronmicroscopy(scalebar:2μm;Redarrow,the
autophagosome)(D);thelevelsofATG5andATG7weredetectedbyusingqPCRandWesternblottingassays,respectively(E).(F)TheC57BL/6miceweresubjectedtoDSS-inducedcolitismodel,lonicerin(3,10,and30mg/kg)and5-ASA(mg/kg)wereorallyadministrateddailyforconsecutive10days.Attheendoftheexperiment,themiceweresacrificed,thecolonswerecollectedandtheproteinexpressionofATG5incolonswasdetectedbyusingtheWesternblottingassay.Dataareexpressedasmean±SEMofatleastthreeindependentexperimentsorsixmiceineachgroup.*P0.05and**P0.01vs.LPSgrouporDSSgroup.
Figure5LonicerininactivatesNLRP3inflammasomeviaautophagy.ThedifferentiatedTHP-1cells，andBMDMsweretransfectedwithATG5shRNAandpre-treatedwithLPS(ng/mL)for3h,andthenculturedwithlonicerin(30μmol/L)for6h,followedby1hincubationwithATP(5mmol/L).(A)TheassemblyofNLRP3inflammasomewasdetectedbyusingco-immunoprecipitationassay.(B)
Theproteinexpressionsofcleavedcaspase-1andcleavedIL-1βweredetectedbyusingWesternblottingassay.(C)TheproductionofIL-1βandIL-18wasdetectedbyusingELISA.Dataareexpressedasmean±SEMofatleastthreeindependentexperiments.##P0.01vs.normalgroup;**P0.01vs.LPS+ATPgroup;P0.01vs.lonicerin(30μmol/L)+scrambleshRNAgroup.
5忍冬素通过靶向EZH2诱导ATG5的表达并抑制NLRP3炎症小体的活化
5.1实验设计
为了探讨ATG5mRNA的表达是否受表观遗传因素的控制，首先进行了DNA甲基化和组蛋白修饰的实验。细胞热转移试验(CETSA)以研究忍冬苷与EZH2的相互作用。利用溶剂诱导蛋白沉淀试验（SIP）来证实忍冬苷与EZH2的相互作用。分子对接分析忍冬苷与EZH2结合的模式。EZH2酶活性实验验证忍冬苷对EZH2的抑制作用。
5.2结果
DNA甲基化结果发现ATG5和ATG7启动子区DNA甲基化水平无变化。然而，在ATG5启动子上检测到了H3K27me3的富集变化，而在ATG7上没有检测到H3K27me3在mRNA水平上的变化（图6A和图6B）。基因抑制标记H3K27me3主要通过多梳抑制复合物2(PRC2)和EZH2是PRC2中的核心甲基转移酶。因此决定评估忍冬苷参与调节EZH2功能。但是没有发现治疗组与未治疗组蛋白质表达差异(图6C)。CETSA实验发现与DMSO空白相比，忍冬苷将EZH2的热稳定性提高了约6.0°C(图6D)。分子对接分析揭示了忍冬苷与EZH2结合的模式(PDB：5LS6，图6E)
EZH2酶活性实验证实了忍冬苷抑制了EZH2的活性（图6F）。
Figure6LonicerindirectlybindstotheEZH2.(A)–(C)ThedifferentiatedTHP-1cellsandBMDMsweretreatedwithLPS(ng/mL)for3h,andthenculturedwithlonicerin(3,10,and30μmol/L)for6h.TheDNAmethylationonAtg5andAtg7promoterwasdetectedbyusingthemethylation-specificPCRassay,MstandsformethylatedandUstandsforunmethylated(A);theenrichmentofH3K27me3inAtg5andAtg7promoterwasanalyzedbyusingthechromatinimmunoprecipitationassay(B);theproteinexpressionofEZH2wasdetectedbyusingWesternblottingassay(C).(D)ThedifferentiatedTHP-1cellsandBMDMswereincubatedwithDMSOor
lonicerin(30μmol/L)for1h,andthewholecelllysiswassufferedfromCETSAassaytodetectthestabilizationofEZH2.(E)TheinteractionbetweenlonicerinandEZH2wasdetectedbyusingmoleculardocking.(F)TheenzymecatalyticactivityofEZH2invitrowasdetectedbyusingtheEZH2ChemiluminescentAssayKit.(G)ThedifferentiatedTHP-1cellsweretransfectedwithTyr,His,Tyr,ArgmutationplasmidsandthentreatedwithDMSOorlonicerin(30μmol/L)for
1h.TheinteractionbetweenlonicerinandEZH2wasdetectedbyusingCETSAassay.Dataareexpressedasmean±SEMofatleastthreeindependentexperiments.*P0.05,**P0.01vs.LPSgroup.
6忍冬苷-EZH2相互作用的机理
6.1方法
分子动力学模拟评估金银花素和EZH2配合物的稳定性，染色质免疫沉淀实验探讨了与这些残基的相互作用是否需要ATG5介导的自噬和NLRP3炎症体灭活作用。
6.2结果
RMSD和RMSF值表明蛋白质-配体复合物在给定的模拟时间段内（ns）稳定，并且参与这些相互作用的关键残基的波动范围低于1.0?（图8A和图8B）。计算出的结合自由能显示范德华（–58.89kcal/mol）和静电（–43.57kcal/mol）主要促成这种蛋白质与配体的相互作用（图8C），在总结合能（–86.2kcal/mol）中，氢键和疏水作用起主要作用（图8D）。正如预期的那样，CETSA和SIP结果均表明，这些向丙氨酸的突变影响了EZH2和lonicerin复合物的物理稳定性，正如预期的那样，CETSA和SIP结果均表明，这些向丙氨酸的突变影响了EZH2和lonicerin复合物的物理稳定性（图6G）。HA和RA的稳定性曲线比YA和YA的曲线向空白组转移的更多，这表明这两个残基对忍冬苷的结合具有增强的亲和力。染色质免疫沉淀结果显示用HA和RA突变质粒转染不仅效果显着降低了ATG5的水平，但也减弱了LONICErin对THP-1细胞中NLRP3炎性体激活的抑制作用。HA和RA的协同作用完全逆转了ATG5的表达升高以及随后NLRP3炎性小体的失活。表明阻断EZH2甲基转移酶活性会完全丧失忍冬苷的保护作用。
7验证忍冬素通过调节EZH2/ATG5-自噬/NLRP3炎症体激活而减轻结肠炎
7.1实验设计
实验分组为正常组、DSS组、超表达质粒组、EZH2过表达质粒组(10μg)、忍冬苷(30mg/kg)+超表达质粒组(30mg/kg)+EZH2过表达质粒组，检测指标DAI评分、结肠长度、脾系数、MPO活性、(HE)染色及免疫荧光共定位，对结肠区生物标志物ATG5、LC3B-I/II和裂解的caspase-1进行Westernblotting分析。
7.2结果
EZH2质粒能明显逆转忍冬苷的改善作用(图8A-E)。苏木精和伊红(HE)染色及免疫荧光共定位显示，EZH2质粒在结肠形态计量学和巨噬细胞形态学观察中均对抗蓝菌素的保护作用(图8F和G)。Westernblotting分析证实EZH2质粒能逆转忍冬苷增强的ATG5介导的自噬和NLRP3炎症小体失活。
Figure8LonicerinattenuatescolitisthroughregulatingtheEZH2/ATG5-autophagy/NLRP3inflammasomeactivation.TheC57BL/6miceweresubjectedtotheDSS-inducedcolitis.Thelonicerin(30mg/kg)wereorallyadministrateddailyforconsecutive10days.ThescrambleplasmidandEZH2plasmidwasmixedwithequalvolumeEntransterinvivotransfectionreagent,andintracolonically(i.c.)administereddailyforconsecutive10days.(A)Thebodyweightchange,(B)thediseaseactivityindex(DAI),(C)thecolonlength,(D)thespleenindex,(E)themyeloperoxidase
(MPO)activityincolonswasmeasured.(F)ThepathologicalchangesofcolonsweredetectedbyusingHEstaining,andtheimagesweretakenat×magnification(scalebar:50μm).(G)Theinfiltrationofmacrophagesincolonswasdetectedbyusingimmunofluorescenceassay,andtheimagesweretakenat×magnification(Scalebar:50μm).(H)and(I)TheproteinexpressionsofATG5,LC3B-I/IIandcleaved-caspase-1incolonsweredetectedbyusingWesternblottingassay.
Dataareexpressedasmean±SEMofsixmiceineachgroup;##P0.01vs.normalgroup;**P0.01vs.DSSgroup.P0.01vs.lonicerin(30mg/kg)+scrambleplasmidgroup.
总结
本文深入研究的了从金银花中分离得到的黄酮苷类化合物-忍冬苷治疗溃疡性结肠炎的机制，首先本实验先确定了忍冬苷治疗UC的药效，通过心、肝、脾、肺、肾的观察证明了不同剂量的忍冬苷口服无副作用。第二步分离上述实验结肠上的细胞，从而知道忍冬苷特异性的抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体，并通过NLRP3炎症小体不同激活剂作用不同细胞的结果发现忍冬苷能广谱的抑制NLRP3炎症小体。共沉淀发现忍冬苷引起NLRP3的溶酶体降解从而抑制NLRP3炎症小体的表达。另外发现忍冬苷介导的自噬相关蛋白5（ATG5）抑制NLRP3炎症激活，为探讨ATG5mRNA的表达是否受表观遗传因素的控制，发现忍冬苷与EZH2的相互作用，忍冬苷对EZH2有抑制作用，利用分子对接等寻找两者结合的模型，并通过分子动力学和染色质免疫沉淀得出阻断EZH2甲基转移酶活性会完全丧失忍冬苷的保护作用。最后动物实验验证忍冬素通过调节EZH2/ATG5-自噬/NLRP3炎症体激活而减轻结肠炎。最终得出结论忍冬苷对NLRP3炎症小体的激活有抑制作用。这一机制可能与EZH2/ATG5介导的自噬调节有关。
本文实验设计严谨，一步步的论证了忍冬苷治疗UC的过程。本文偏于药效学机制研究，对于这方面研究需求可以借鉴其实验设计思路。
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